Վիրուսի նուկլեինաթթվի հայտնաբերում

Հայտնի են վիրուսների մեծ մասի գենոմային հաջորդականությունը:Նուկլեինաթթվի զոնդերը, որոնք ԴՆԹ-ի կարճ հատվածներ են, որոնք նախատեսված են վիրուսային ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի լրացուցիչ հատվածների հետ հիբրիդացման համար:Պոլիմերազային շղթայական ռեակցիան (PCR) վիրուսների հայտնաբերման ավելի արդյունավետ մեթոդ է:Վերջերս մշակվել են բարձր թողունակության ախտորոշման մեթոդներ:

Ա. Նուկլեինաթթվի հիբրիդացման տեխնիկա

Նուկլեինաթթվի հիբրիդացումը, որը հիմնականում ներառում է Southern blotting (Southern) և Northern blotting (Northern), արագ զարգացող նոր տեխնիկա է վիրուսների ախտորոշման ոլորտում:Հիբրիդացման հետազոտության հիմնավորումն է օգտագործել ԴՆԹ-ի կարճ հատվածները (կոչվում են «զոնդ»), որոնք նախատեսված են կոմպլեմենտար վիրուսային ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ հատվածների հետ հիբրիդացնելու համար:Ջեռուցման կամ ալկալային մշակման միջոցով երկշղթա թիրախային ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն բաժանվում են առանձին շղթաների, այնուհետև անշարժացվում են ամուր հենարանի վրա:Դրանից հետո զոնդը ավելացվում է և հիբրիդացվում թիրախ ԴՆԹ-ի կամ ՌՆԹ-ի հետ:Քանի որ զոնդը պիտակավորված է իզոտոպով կամ ոչ ռադիոակտիվ նուկլիդով, թիրախ ԴՆԹ-ն կամ ՌՆԹ-ն կարող է հայտնաբերվել ավտոռադիոգրաֆիայի կամ բիոտին-ավիդին համակարգի միջոցով:Քանի որ վիրուսային գենոմների մեծ մասը կլոնավորվել և հաջորդականացվել է, դրանք կարող են հայտնաբերվել՝ օգտագործելով վիրուսին հատուկ հաջորդականությունները՝ որպես նմուշի զոնդեր:Ներկայումս հիբրիդացման մեթոդները ներառում են՝ կետային բլոտ, in situ հիբրիդացում բջիջներում, ԴՆԹ բլոտինգ (ԴՆԹ) (Southern blot) և ՌՆԹ բլոտինգ (ՌՆԹ) (Northern blot):

B.PCR տեխնոլոգիա

Վերջին տարիներին PCR-ի հիման վրա ստեղծվել են in vitro նուկլեինաթթվի ուժեղացման մեթոդներ՝ անզգայուն կամ անմշակ վիրուսները փորձարկելու համար:PCR-ն մեթոդ է, որը կարող է սինթեզել ԴՆԹ-ի հատուկ հաջորդականությունը in vitro պոլիմերազային ռեակցիայի միջոցով:PCR-ի գործընթացը ներառում է երեք փուլից բաղկացած ջերմային ցիկլ՝ դենատուրացիա, կռում և երկարացում Բարձր ջերմաստիճանում (93℃~95℃) երկշղթա ԴՆԹ-ն բաժանվում է երկու առանձին ԴՆԹ շղթաների.այնուհետև ցածր ջերմաստիճանում (37℃~60℃), երկու սինթեզված նուկլեոտիդային այբբենարան զտվում են ԴՆԹ-ի կոմպլեմենտար հատվածներին.մինչդեռ Taq ֆերմենտի համար համապատասխան ջերմաստիճանում (72℃), ԴՆԹ-ի նոր շղթաների սինթեզը սկսվում է այբբենարանի 3' վերջից՝ օգտագործելով կոմպլեմենտար ԴՆԹ որպես կաղապարներ և առանձին նուկլեոտիդներ՝ որպես նյութեր:Այսպիսով, յուրաքանչյուր ցիկլից հետո մեկ ԴՆԹ շղթա կարող է ընդլայնվել երկու շղթայի:Կրկնելով այս գործընթացը՝ մեկ ցիկլում սինթեզված ԴՆԹ-ի յուրաքանչյուր շղթա կարող է օգտագործվել որպես կաղապար հաջորդ ցիկլում, և ԴՆԹ շղթաների թիվը կրկնապատկվում է յուրաքանչյուր ցիկլում, ինչը նշանակում է, որ PCR-ի արտադրությունն ուժեղանում է 2n log արագությամբ:25-ից 30 ցիկլից հետո PCR-ի արտադրությունը բացահայտվում է էլեկտրոֆորեզի միջոցով, և ԴՆԹ-ի հատուկ արտադրանքները կարող են դիտվել ուլտրամանուշակագույն լույսի ներքո (254 նմ):Իր առանձնահատկությունների, զգայունության և հարմարության համար ՊՇՌ-ն ընդունվել է բազմաթիվ վիրուսային վարակների կլինիկական ախտորոշման համար, ինչպիսիք են HCV, ՄԻԱՎ, CMV և HPV:Քանի որ PCR-ը շատ զգայուն է, այն կարող է հայտնաբերել վիրուսի ԴՆԹ-ն fg մակարդակով, վիրահատությունը պետք է կատարվի շատ ուշադիր՝ կեղծ դրականից խուսափելու համար:Բացի այդ, նուկլեինաթթվի թեստի դրական արդյունքը չի նշանակում, որ նմուշում կենդանի վարակիչ վիրուս կա:

PCR տեխնիկայի լայն կիրառմամբ, տարբեր փորձարկման նպատակով ՊՇՌ տեխնիկայի հիման վրա մշակվում են նոր տեխնիկա և մեթոդներ:Օրինակ, իրական ժամանակի քանակական PCR-ն կարող է հայտնաբերել վիրուսային բեռը.in situ PCR օգտագործվում է հյուսվածքներում կամ բջիջներում վիրուսային վարակը հայտնաբերելու համար.Ներդրված ՊՇՌ-ն կարող է մեծացնել ՊՇՌ-ի առանձնահատկությունը:Դրանցից ավելի արագ է մշակվել իրական ժամանակի քանակական PCR:Շատ նոր մեթոդներ, ինչպիսիք են TaqMan հիդրոլիզի զոնդը, հիբրիդացման զոնդը և մոլեկուլային փարոսային զոնդը, համակցվել են իրական ժամանակի քանակական PCR տեխնիկայի մեջ, որը լայնորեն օգտագործվում է կլինիկական հետազոտություններում:Բացի հիվանդների մարմնի հեղուկում վիրուսային ծանրաբեռնվածությունը ճշգրիտ որոշելուց, այս մեթոդը կարող է օգտագործվել նաև դեղամիջոցի նկատմամբ հանդուրժող մուտանտի հայտնաբերման համար:Հետևաբար, իրական ժամանակի քանակական PCR-ն հիմնականում կիրառվում է բուժիչ ազդեցության գնահատման և դեղերի նկատմամբ հանդուրժողականության հսկողության մեջ:

Գ. Վիրուսային նուկլեինաթթուների բարձր թողունակության հայտնաբերում

Նոր առաջացող վարակիչ հիվանդությունների արագ ախտորոշման կարիքները բավարարելու համար ստեղծվել են բարձր արդյունավետության հայտնաբերման տարբեր մեթոդներ, ինչպիսիք են ԴՆԹ-ի չիպերը (ԴՆԹ):ԴՆԹ-ի չիպերի համար հատուկ զոնդերը սինթեզվում են և կցվում են շատ բարձր խտությամբ փոքր սիլիցիումի չիպերին՝ ձևավորելու ԴՆԹ-ի զոնդի միկրոզանգվածը (ԴՆԹ), որը կարող է հիբրիդացվել նմուշի հետ:Հիբրիդացման ազդանշանը կարելի է պատկերել կոնֆոկալ մանրադիտակի կամ լազերային սկաների միջոցով և հետագայում մշակվել համակարգչի կողմից և ստանալ տարբեր գեների վերաբերյալ հսկայական տվյալների հավաքածու:ԴՆԹ-ի երկու տեսակ կա.«Սինթեզի չիպը» հետևյալն է. հատուկ օլիգոնուկլեոտիդները սինթեզվում են անմիջապես չիպերի վրա:Մյուսը ԴՆԹ ավազանի չիպն է:Կլոնավորված գեները կամ PCR արտադրանքները կարգով տպվում են սլայդի վրա:ԴՆԹ չիպի տեխնոլոգիայի առավելությունը ԴՆԹ-ի հսկայական քանակի հաջորդականությունների միաժամանակյա հայտնաբերումն է:Պաթոգենների հայտնաբերման չիպի վերջին տարբերակը կարող է միանգամից բացահայտել ավելի քան 1700 մարդու վիրուս:ԴՆԹ չիպի տեխնոլոգիան լուծեց նուկլեինաթթվի հիբրիդացման ավանդական մեթոդների խնդիրները և շատ լայն կիրառություն ունի վիրուսային ախտորոշման և համաճարակաբանական ուսումնասիրության մեջ: